После уничтожения «Нормандии СР-1» неопознанным кораблём (как выясняется в процессе прохождения — кораблём коллекционеров), организация «Цербер» запускает проект «Лазарь» с целью воскрешения капитана Шепарда. Восстановление длится чуть более 2 лет, всё это время Шепард находится в коме. После неожиданного и несвоевременного пробуждения, Шепард встречается с загадочным руководителем «Цербера» Призраком. В ходе разговора с ним становится ясно, почему «Цербер» взялся за оживление Шепарда. Всё то время, что капитан находился в коме, человеческие колонии исчезали без следа. Призрак предлагает капитану Шепарду взяться за это дело: расследовать исчезновения колонистов. В процессе расследования выясняется, что за таинственными похищениями стоят коллекционеры. Так как «Нормандия СР-1» была уничтожена, а команда Шепарда разбрелась по разным участкам Галактики, «Цербер» предоставляет капитану новый корабль «Нормандия СР-2», путешествуя на котором, игроку предстоит собрать новую команду. В ходе миссии по спасению человечества капитану Шепарду предстоит побывать во множестве знакомых, а также совершенно незнакомых уголках Галактики. Капитану необходимо совершить невозможное: отправиться вслед за Коллекционерами в их логово через ретранслятор Омега-4. Так как никто не знает, что же находится на другой стороне и куда ведёт ретранслятор, Шепарду предстоит во всём разобраться, отправившись на «Самоубийственную миссию»…